【本讲教育信息】

一、教学内容

动物细胞工程——动物细胞融合与单克隆抗体

二、良好开端

本节重点：理解和掌握动物细胞融合的原理、过程和意义；列表比较动物细胞融合与植物体细胞杂交的异同；理解和掌握单克隆抗体制备的过程的步骤和应用。

本节难点：单克隆抗体的制备过程

三、成功之旅

【知识点1】动物细胞融合

1、概念：动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。

2、结果：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。

3、原理：细胞膜的流动性。

4、诱导方法：

物理法：离心、振动、电刺激

化学法：聚乙二醇（PEG）

生物法：灭活的病毒

灭活的病毒诱导细胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。其中的灭活是指用物理（如紫外线等）或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构。

5、过程：如下图所示

包括细胞膜融合、细胞质融合和细胞核融合。细胞膜融合是细胞融合的先导，没有细胞膜的融合就不会有细胞质和细胞核的融合。具体过程是：

具有不同DNA的两个或多个细胞杂交细胞，

融合后形成的杂交细胞具有两个细胞的遗传信息，通过动物细胞培养，杂交细胞表现出两个亲本的特点。

6、意义：

克服了远缘杂交不亲和的障碍；目前这一技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。

7、动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较

动物细胞融合与植物体细胞杂交的异同

比较项目

细胞融合的原理

细胞融合的方法

诱导手段

用途

植物体细胞杂交

细胞膜的流动性

用纤维素酶、果胶酶去除细胞壁后诱导原生质体融合

离心、电刺激、振动、聚乙二醇（PEG）诱导

克服远缘杂交不亲和，扩展杂交亲本的范围，培育新品种

动物细胞融合

细胞膜的流动性

用胰蛋白酶使细胞分散后诱导细胞融合

除应用植物细胞杂交手段外，还可用灭活病毒诱导

制备单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素等

例题1、动物细胞培养与植物组织培养的重要区别在于

A. 培养基不同

B. 动物细胞培养不需要在无菌条件下进行

C. 动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能

D. 动物细胞能够大量培养，而植物细胞不能

解析：动物细胞培养所用的培养基是液体培养基，其中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。而植物细胞培养所用的培养基是固体培养基，通常含有水、矿质元素、激素、蔗糖、氨基酸、琼脂等。可见，动物细胞培养所用的培养基与植物组织培养所用的培养基是不同的。

答案：A

【知识点2】单克隆抗体

（一）概念：由单个浆细胞进行无性繁殖，形成细胞群（称为克隆），由这样的细胞群产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。

（二）单克隆抗体的制备：

1、归纳起来讲，单克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：

1）抗原制备；2）免疫动物； 3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；4）细胞融合；5）杂交瘤细胞的选择培养；6）杂交瘤细胞的筛选；7）杂交瘤细胞的克隆化；8）单克隆抗体的检定；9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；10）单克隆抗体的大量制备。现重点强调以下五个关键的步骤：

1）免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞（或效应B淋巴细胞即浆细胞）的过程。一般选用6-8周龄雌性小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

2）细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

3）选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活而逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤－鸟嘌呤－磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

4）杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

5）单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。

①体内诱生法取实验小鼠，首先在其腹腔注射0.5mL液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。

②体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。

2、血清抗体与单克隆抗体的区别

①血清抗体：产量低、种类多、纯度差、特异性差、反应不够灵敏。

②单克隆抗体：化学性质单一、特异性强、灵敏度高。

3、制备过程中要经过两次筛选

第一次筛选：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合之后，有三种融合情况：B淋巴细胞与B淋巴细胞融合、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。而只有B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞才是真正需要的杂种细胞。

第二次筛选：在杂交瘤细胞中筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。

（三）单克隆抗体的应用

1、单克隆抗体可以作为诊断试剂，准确识别各种抗原物质，与抗原的特异性结合具有准确、高效、简易、快速的特点。

2、单克隆抗体还可以用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症。单克隆抗体作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”，准确杀伤癌变细胞。

例题2、下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。请据图回答：

（1）该方案能达到预期效果吗？　　。原因是　　　　。

（2）图中②为　　　过程，常用　　　　作为诱导剂。该细胞继承了　　　，因此不仅能　　　，还有　　　　本领。

（3）图中③进行细胞培养，目的是。

（4）在制备破伤风杆菌抗体的过程中，进行了两次筛选，其目的不同，②是通过筛选获得，④是通过筛选获得。

（5）图中⑤的培养能获得细胞，便于大规模培养。

（6）破伤风杆菌的抗体最终可从和中提取。

（7）该方案的目的是　　。

解析：B淋巴细胞有以下特点：①在体外不能无限增殖；②只有受到抗原刺激后才能形成效应B细胞（浆细胞），产生相应的抗体；③与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞后既可无限增殖，又能产生大量所需抗体。单克隆抗体制备过程首先需要注射与产生的单克隆抗体发生特异性免疫反应的抗原，否则，小鼠体内不会发生特异性免疫反应，不会产生合成所需抗体的效应B细胞（浆细胞）。获得效应B细胞（浆细胞）后，因为效应B细胞（浆细胞）不能在体外大量增殖，虽能产生抗体，但数量有限，因此需要与骨髓瘤细胞融合，融合必须在诱导剂的诱导下才能发生，常用的是灭活的病毒。两细胞的融合是自由的，有三种情况：B淋巴细胞—B淋巴细胞，骨髓瘤细胞—骨髓瘤细胞，B淋巴细胞—骨髓瘤细胞，我们需要的是杂种细胞，它结合了双亲的遗传物质，具备大量增殖和产生抗体的能力，所以需经过培养筛选。第一次筛选是选择需要的杂交瘤细胞，第二次筛选是在杂交瘤细胞中选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。然后通过扩大培养后就可转移到体外培养液中或小鼠腹腔中产生大量的单克隆抗体。

答案：（1）不能没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生单一抗体的效应B细胞

（2）细胞融合和筛选灭活的病毒双亲细胞的遗传物质大量繁殖产生特异性抗体（3）在体外条件下大量增殖（4）杂交瘤细胞能产生特定抗体的杂交瘤细胞

（5）足够量杂交瘤（6）细胞培养液小鼠腹水（7）制备单克隆抗体

四、考点分析

单克隆抗体的制备和应用是近几年发展的热点，其制备过程和应用原理是个常考点，以非选择题的形式出现时，应特别注意语言的严谨性和准确性。

五、小结

1、动物细胞融合

2、单克隆抗体的获得

3、单克隆抗体的应用

【模拟试题】（答题时间：70分钟）

一、选择题

*1. 单克隆抗体制备过程中使用的骨髓瘤细胞是一种缺陷型细胞，在含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶的培养基（HAT）中无法生长；而小鼠脾细胞是正常细胞，在HAT培养基上可正常存活。用聚乙二醇诱导细胞融合后，经过数代培养，最终可在HAT培养基上存活并能产生单克隆抗体的细胞是（）

A. 骨髓瘤细胞之间形成的融合细胞

B. 脾细胞之间形成的融合细胞

C. 骨髓瘤细胞与脾细胞之间形成的融合细胞

D. 脾细胞

2. 研究单克隆抗体治疗癌症的思路是（）

A. 利用单克隆抗体特异性地对抗癌细胞

B. 以单克隆抗体作抗癌药物杀死癌细胞

C. 抗癌物质在克隆细胞中大量合成

D. 单克隆抗体携带抗癌药物特异性地与癌细胞结合

3. 科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（）

A. 经过免疫的B淋巴细胞 B. 不经过免疫的T淋巴细胞

C. 经过免疫的T淋巴细胞 D. 不经过免疫的B淋巴细胞

4. 用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中错误的是（）

A. 将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B淋巴细胞

B. 用纤维素酶处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞

C. 用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合

D. 筛选杂交瘤细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体

5. 只能使动物细胞融合的常用诱导方法是（　）

A. PEG　　 B. 灭活的病毒 C. 电刺激 D. 离心

6. 单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的（　）

A. B淋巴细胞 B. T淋巴细胞 C. 骨髓瘤细胞 D. 杂交瘤细胞

*7. 用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（　）

A. 容易产生各种变异 B. 具有更强的全能性

C. 取材十分方便　　 D. 分裂增殖的能力强

8. 动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（　）

①诱导融合的方法完全相同 ②所用的技术手段不相同

③所采用的原理完全相同 ④都能形成杂种细胞

A. ①② B. ①③ C. ②④ D. ③④

*9. 动物细胞融合和植物原生质体融合决定于（　）

A. 细胞膜的流动性 B. 细胞膜的选择透过性

C. 细胞质的流动性　　 D. 细胞质酶的活性

10. 从母羊甲的体细胞中取出细胞核，注入到母羊乙去掉核的卵细胞中，融合后的细胞经卵裂形成早期胚胎，再植入到另一只母羊丙的子宫内，出生小羊的大多数性状（　）

A. 难以预测 B. 像甲 C. 像乙 D. 像丙

11. “生物导弹”是指（　）

A. 单克隆抗体 B. 杂交瘤细胞

C. 能产生特定抗体的B淋巴细胞　 D. 在单抗上连接抗癌药物

12. 动物细胞工程技术的基础是（　）

A. 动物细胞融合　 B. 单克隆抗体

C. 胚胎移植　　 D. 动物细胞培养

13. 下列哪一项属于克隆（　）

A. 将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中

B. 将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内

C. 将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞

D. 将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系

14. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞。在这种培养基上不能存活、增殖的细胞是

①B淋巴细胞 ②小鼠骨髓瘤细胞

③B淋巴细胞自身融合细胞 ④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞

⑤杂交瘤细胞

A. ①②③④ B. ①③⑤ C. ②④ D. ①③

*15. 关于单克隆抗体，下列叙述不正确的是（　）

A. 可以制成诊断盒，用于疾病的诊断

B. 可以与药物结合，用于病变细胞的定向治疗

C. 可以利用基因工程技术生产

D. 可以在生物体内生产，不能在体外生产

*16. （多选）1975年米尔斯坦和柯勒成功地获得了单克隆抗体。下列细胞中与单克隆抗体的制备有关的是（　）

A. 效应B细胞 B. T淋巴细胞 C.骨髓瘤细胞 D. 杂交瘤细胞

二、非选择题

1. 下图是单克隆抗体制备过程示意图，据图回答：

（1）图中A过程是从小鼠的脾脏中取得的___________细胞，该细胞能够产生_________。从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射_____________类物质。

（2）B过程是一个_____________过程，该过程的进行需要灭活的_____________或_____________的诱导。

（3）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，其特点是_________________。

*2. 两场筹备了10年的“太空结合”首次在神舟四号飞船上举行了，“新人”之一是小白鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，新人在“产房”——电融合仪内孕育新生命。160min后，中国首批“太空娃娃”终于顺利诞生。“太空娃娃”诞生和地面实验如图所示。请回答下列问题：

（1）小白鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞能融合在一起，体现了细胞膜具有__________的特点。

（2）若用于SARS的预防上，则宜采用_______细胞。科学工作者正在研究治疗癌症使用的生物导弹是_______。

（3）B淋巴细胞和T淋巴细胞都是由________________细胞形成的。这种相同细胞的后代，在形态、结构和生理功能上产生稳定差异的过程，叫做_ 。

（4）鼠的淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，在培养时通过_______________（有丝/减数）分裂方式大量繁殖。细胞中染色体数目与淋巴细胞相比有何特点？_____________；要观察融合后的细胞中的染色体形态、数目，可用一定浓度的___ _____处理。

（5）融合的细胞具有两种细胞的特性，即_________________和____________________。

3. 1975年科学家首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。请观察下图，回答问题：

（1）单克隆抗体是指，其特点。

（2）1984年以来，科学家针对如右图所示的单克隆抗体来自，应用于人体，会作为产生，加速排斥反应，以及完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透肿瘤组织，达不到有效治疗的浓度等问题，制备出可用于肿瘤治疗的相对分子质量小的单克隆抗体。

（3）制备单克隆抗体的B淋巴细胞一般从（器官）中采集。从下表看，用于筛选杂交瘤细胞的是特定的培养基。

培养基特殊成分	主要作用
次黄嘌呤	骨髓瘤细胞不能利用
氨基蝶嘌呤	阻断DNA合成
胸腺嘧啶核苷	脾细胞用于合成DNA

（4）大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：

①体外培养法，可获得10μg/mL的抗体；②动物体内诱生法可获得5~20mg/mL的抗体。你选择的方法及原因是。

【试题答案】

一、选择题

CDABB DDCAB DDDAD （ABCD）

二、非选择题

1.（1）效应B 抗体抗原（2）细胞融合仙台病毒聚乙二醇（3）特异性强、灵敏度高

2.（1）一定的流动性（2）SARS病毒感染后产生的效应B 单克隆抗体+抗癌药物

（3）造血干细胞分化（4）有丝加倍龙胆紫溶液（5）无限增殖产生单一抗体

3. （1）化学性质单一，特异性强的抗体特异性强，灵敏度高

（2）鼠异物免疫反应（3）脾选择

（4）大量生产选①，小规模生产选② （答案合理即可）